多肽固相合成法怎麼防水

⑴ 多肽固相合成法的保護

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成醯胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成後再將保護洞檔基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多採用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發生消旋。最早是用苄氧羰基，由於它需要較強的酸解條件才能脫除，所以後來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人採用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的應用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用於片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；苄酯常用催化氫化除去。對於合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸桐凳等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由於側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成醯胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最後肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。
固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內並不形成肽鍵，要形成醯胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、醯氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成醯胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。
裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA，有時根據條件不同，其它鹼、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被採用。合成肽鏈進一步的精製、分離納輪亂與純化通常採用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。

⑵ 多肽固相合成法的分析

分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μ m）做填料凳正嘩。由此多肽要在幾分鍾內高度被分析。
HPLC分兩類：離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。 分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以後逐漸加強或一步一步加強，直到多肽從柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由於洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。清友 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鍾0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那麼大小是8×100（3-10μm）和25×250mm(10μ m)。
大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不棗行同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露於高pH，甚至微鹼pH，因為這樣會破壞柱子。
Fmoc―氨基酸的制備和側鏈保護
Fmoc基團是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六環溶液中，理想的Fmoc-氨基酸的側鏈保護基應在鹼性條件下穩定，在酸性條件下脫除..

⑶ 多肽固相合成法的介紹

多肽固相合成法——英文櫻稿譽解釋： solid phase peptide synthesis 簡寫為SPPS。在肽合成的技術方面取得了突破性進展的是R.Bruce Merrifield，他敬肢設計了一種肽的合成途徑並定名為固相合成途徑。由於R.BruceMerrifield在肽合成方脊段面的貢獻，1984年獲得了諾貝爾獎。

⑷ 多肽固相合成樹脂存放條件

多肽固相合成樹脂存放條件是：首先，多肽固相合成樹脂應該存放在乾燥、清潔的室內環境中，避免陽燃畝光直射；其次，多肽固相合成樹脂應該存放在室溫下，溫度不宜過高或過低，一般在4-25℃之間；再次，多肽固相合成樹脂應該存放在濕度低的環境中，濕度不宜超過60%；最後，多肽固相合成樹脂應該存皮肆森放在通風良好的環境中，避免污染物和有害氣雹譽體的污染。

⑸ 多肽固相合成法的介紹

雖然Merrifield在發明固相多肽合成科學並取得巨大成功的同時，使用了自主研發的合成設備，但卻沒因此將多肽合成儀引入市場。1970年，Beckman公司開發的全自動多肽合成儀Beckman 990 Peptide Synthesizer 作為第一台投入市場的科研用多肽合成儀，被美國多所大學的實驗室採用。
幾乎同一時間，Vega Biotechnologies, Inc.公司開發出兩款經濟型多肽合成儀：Vega』s Coupler 1000與Vega』s Coupler 250 (不久又推出Vega』s Coupler 296),其將多肽合成後續的在線切割理念結合到設備中，所有反應器採用防爆玻璃材質，防止TFA的腐蝕。被當時的肽化學界稱為最經濟適用的多肽合成儀。
而今，Beckman與Vega』s兩家公司均停止的多肽合成儀的研發與製造，而轉向到更多面的化學合成、分離、檢測技術設備的研製產業中。 第一代多肽合成儀是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega』s Biotechnologies公司推出的Vega』s 296 Peptide Synthesizer為代表的，誕生在上世紀七十年代。
雖然隨著生產工藝的改進和發展，如今第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發而來，第一代的多肽合成儀為之後的合成儀研發與製造產生了重大意義。
第二代多肽合成儀是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90為代表的，誕生在上世紀八十年代。此兩款設備也是目前市場上仍在銷售的最早的多肽合成儀。
PS3 的設計原理是採用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會「抱團」，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除後要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓力會把賣判多肽-固相載體「吹」到反應器液面上方。由於多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反應「死角」的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發，液面降低後一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。
ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。
第三代多肽合成儀是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336為代表的無死角多肽合成儀為代表的，誕生在上世紀九十年代。
ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正中搭改做到了無死角。由於攪拌速率可達每分鍾1800轉的高速，反應得以充分枝首完全。由於無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場後最後一款儀器）至今在世界上還佔有著很大的比例。當然，ABI產品的售價也是最高的。由於部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。
CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其採用了氮氣鼓泡反應方式的優越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現。 進入二十世紀以來，各大合成儀製造公司相繼推出了升級產品和新產品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將「簡訊通知」功能融入產品，增添了用戶與設備之間的緊密感，更加人性化；C S Bio公司對其從研發型到生產型設備的UV Online Monitor系統配置統一升級，用戶可直觀看到每一部氨基酸偶聯反應的狀態並可根據數據調整出最佳合成效果與工藝；Advanced ChemTech公司自2005年破產重組後分裂為兩家新公司，其中Aapptec延續了其前身的生產步驟，推出Focus XC三通道合成儀。美國另一家公司CEM以蛋白質有機反應設備的製造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡單的小分子多肽。其採用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍。

⑹ 多肽固相合成法的側鏈保護

His是最容易發生消旋化的氨基酸，必須加以保護.
對咪唑環的非π-N開始用苄基(Bzl)和甲基磺醯基(TOS)保護.但這兩種保護基均不太理想.TOS對親核試劑不穩定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，並且產生很大程度消旋.Boc基團是一個較理想的保護基，降低了咪唑環的鹼性，抑制了消旋，成功地進行了一些合成.但是當反復地用鹼處理時，也表現出一定的不穩定性.哌啶羰基在鹼中穩定，但是沒能很好地抑制消旋，而且脫保護時要用很強的親核試劉如.
對咪唑環π-N保護，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護，(Bum)可以用TFA脫除，Bom更穩定些，需用催化氫解或強酸脫保護，Bum是目前很有發展前途的His側鏈保護基，其不足之處在於Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差. Arg的胍基具有強親核性和鹼性，必須加以保護.理想的情況是三個氮都加以保護，實際上保護1或2個胍基氮原子.保護基分四類：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺醯基(4)三苯甲基.
硝基在制備、醯化裂解中產生很多副反應，應用不廣.烷氧羰基應主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯反效率不高，哌啶理時不處穩定，會發生副反應；Adoc保護了兩個非π－N，但有同樣的副反應發生.對磺醯基保護，其中TOS應用最廣，但它較難脫除.近年來2，3，6-三甲基-4-甲氧苯橫醯基(Mtr)較受歡迎，在TFA作用下，30分鍾即可脫除，但是它們都不能完全抑制側鏈的醯化發生.三苯甲基保護基可用TFA脫除.缺點是反應較慢，側鏈仍有醯化反應，且其在DCM、DMF中溶解度不好. 固相中的接肽反應原理與液相中基本一致.將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內，並不形成肽鍵.要形成醯胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，其方法是將它變成混合酸酐，或者將它變為活潑酯、醯氯，或者用強的失去劑(碳二亞胺)也可形成醯胺鍵。
碳二唯中棗亞胺是常用的活化試劑，其中Dcc使用范圍最廣，其缺點是形成了不溶於DCM的DCH，過濾時又難於除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用於固相合成中，它們形成的脲溶於DCM中，經洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop－C1)、氯甲酸異丙酯培銀、氯甲酸異丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成對稱酸酐、SOC12形成醯氯，其餘三種形成不對稱酸酐。 '[)V#e'{8E2c 活化酯法在固相合成中應用最為廣泛.採用過的試劑也指拆很多，近來最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.
HOBt酯反應快，消旋少，用碳二亞胺很容易製得；ODhbt酯很穩定，容易進行分離純化，與HOBt酯具有類似的反應性和消旋性能，它還有一個優越之處，在醯化時有亮黃色、耦聯結束時顏色消失，有利於監測反應；OTDO酯與ODhbt酯類似，消旋化極低，易分離，醯化時伴有顏色從桔紅色到黃色的變化等. b1Z7n+k:E5w3n2E2l7 將碳二亞胺和α－N保護氨基酸直接加到樹脂中進行反應叫做原位法.。
用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-C1等.原位法反應快、副反應少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop醯化時生成致癌的六甲基磷醯胺，限制了其應用. Fmoc法裂解和脫側鏈保護基時可採用弱酸.TFA為應用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應較少.不足之處：Arg側鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有採用強酸脫保護的方法：如用HF來脫除一些對弱酸穩定的保護基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(苄基)保護基等，但是當脫除Asp的吸電子保護基時，會引起環化副反應.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在時，脫保護速度很快.此外，根據條件不同，鹼、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也有應用.
固相合成法對於肽合成的顯著的優點：簡化並加速了多步驟的合成；因反應在一簡單反應器皿中便可進行，可避免因手工操作和物料重復轉移而產生的損失；固相載體共價相聯的肽鏈處於適宜的物理狀態，可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應物，迫使個別反應完全，以便最終產物得到高產率；增加溶劑化，減少中間的產物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯的聚合鏈緊密相混，彼此產生一種相互的溶劑效應，這對肽自聚集熱力學不利而對反應適宜。固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成最終產物的純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。